基加入量约2 ml/孔（六孔板），轻柔洗2次。弃去培养基，轻柔加入S1完全培养基，培养基加入量约2 ml/孔（六孔板），每天换液，连续5天。

注意：该试剂盒从定型内胚层细胞起始，定型内胚层细胞诱导方法见定型内胚层高效分化试剂盒，RC200123。定型内胚层细胞状态对肺类器官诱导成败十分关键，需特别注意。

注意：以上操作方案以六孔板为例，若使用其他器皿可以根据需要自行调整方案。调整方案时建议以细胞密度为稳定因素。细胞培养箱条件为37℃、5% CO₂、饱和湿度。所有培养基在使用前必须进行室温复温。这些注意事项同样适用于以下步骤。

2. S2阶段：S1阶段5天诱导结束后，提前准备好立体培养用基质胶（推荐BD Biosciences公司，货号356237，以下简称3D胶）。S1细胞用DMEM/F12培养基洗2次，加入适量的消化液（RegenTASE，RC200111或ACCUTASE；6孔板每孔700 μl左右，消化液覆盖细胞即可），置于37℃培养箱中消化3-6 分钟。每2分钟置于倒置显微镜下观察，待克隆边缘发亮时即轻柔吸弃消化液。加入适量的S2完全培养基轻柔吹打细胞数次，将细胞悬液移至1.5 ml EP管中，200-300 g离心5分钟。弃上清（20 μl枪头进一步吸弃上清，过多上清残留会影响立体培养），轻轻振荡使细胞团块散开，置于冰上2-3分钟。取100 μl提前准备好的3D胶（冰上）加入细胞，轻柔吹打，使细胞分布均匀，切勿产生大量气泡。按20 μl左右每滴分散滴入六孔板，推荐每孔滴6滴左右，置于37℃培养箱中20分钟左右使3D胶固化，固化后加入3-5 ml的S2完全培养基，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。每2天换液一次，每4-6天传代一次。S2阶段共12天。

注意：试剂准备，BD Biosciences公司货号356237的3D胶使用方法，须将3D胶置于冰上融化，分装后保存于-80℃，避免反复冻融。使用时，提前按置于冰上过夜融化备用。

注意：为了降低消化过程对细胞状态的影响，建议在消化液中加入10 μM的 Y-27632。

注意：移液枪吹打细胞时务必轻柔，切不可产生大量气泡，本试剂盒全程均需注意此问题。

3D传代方法：用无菌巴氏吸管将立体培养的类器官（含3D胶）刮下并转移至1.5 ml EP管中，用1 ml枪头机械吹散胶体， 200-300 g离心5分钟。弃上清（20 μl小枪头进一步吸弃上清，过多上清残留会影响立体培养），置于冰上2-3分钟。取100-200 μl左右提前准备好的3D胶（冰上）加入细胞，并轻柔吹打，使细胞分布均匀，按20 μl左右每滴分散滴入六孔板，推荐每孔滴6滴左右，置于37℃培养箱中20分钟左右，使3D胶固化，固化后加入3-5 ml S2完全培养基，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。

注意： 传代比例1：2到1：4，根据类器官生长情况具体判断。

3. S3阶段：S2阶段诱导12天后，3D培养物用基础培养基轻柔洗2次，加入适量S3完全培养基，S3阶段3D传代同S2阶段，S3阶段共20天，形成立体的含肺谱系多种类型细胞的肺类器官。

特别提示：以上所有操作均在无菌细胞培养室进行，细胞开放操作要在生物安全柜内进行；该研究常用的培养器皿包括培养皿、培养板，也可自行设计方案使用细胞培养瓶、细胞工厂等，请根据实验需要自行选择；细胞的初始状态对分化的成功至关重要，请务必保证初始细胞的可靠性。该试剂盒仅用于定型内胚层细胞向肺类器官分化的研究，用于其他研究时该操作规程仅作为参考。